《Science Bulletin》：具有骨样微环境的压电诱导可控矿化支架实现内源性骨再生

   作者构建了一个组织工程支架（pcm-PLLA），该支架在形态结构、力学、化学和电学性能方面模拟了类骨微环境。超声刺激后，取向PLLA表面发生的压电催化反应促进了多巴胺（DA）的聚合，进而调控了HA晶体的生长，最终获得了具有表面矿化层并保持电活性的组织工程支架。压电催化诱导可控矿化策略使压电纤维具有骨样力学性能。此外，催化形成的HA纳米晶体以合适的尺度均匀沉积在纤维表面，并在降解过程中不断释放Ca²⁺和PO₄ ^3-，为骨生长创造了合适的化学微环境。更重要的是，来自PLLA的压电信号没有被可控矿化层所屏蔽。体外实验表明，内源性干细胞被迅速招募到支架的互联孔结构中，实现了支架与骨的快速整合。超声诱导的电信号输出可以刺激干细胞向成骨细胞分化，从而促进骨再生过程。在大鼠颅骨缺损模型中，支架提供的适当微环境不仅能上调巨噬细胞M2型极化，还能快速启动血管生成。植入后仅4周，pcm-PLLA组缺损面积的87.9%±1.6%被新生成骨组织填充。重要的是，在诱导内源性骨再生后，支架能够被生物体完全降解和吸收。mRNA转录组测序进一步揭示了pcm-PLLA通过上调PI3K信号通路促进骨修复的机制。

图1：仿生压电骨支架的形成及其生物学效应。(a)从宏观、微观到纳米的仿生支架模拟天然骨的结构、机械、电学和化学特性。天然骨由有序的压电胶原纤维和胶原纤维排列的透明质酸组成，相应的仿生支架由有序的压电PLLA纤维和表面的透明质酸颗粒组成。(b)压电仿生支架通过干细胞募集、干细胞分化、抗炎和血管生成四种方式作用于骨缺损，导致骨再生。支架释放钙离子来改变化学环境，允许干细胞的募集，干细胞通过超声压电向成骨分化。骨样微环境促进巨噬细胞的m2型极化，增加血管生成。支架通过影响间充质干细胞中的钙通道和PI3K信号通路促进成骨分化。(c)支架的生物降解过程可分为三个阶段：**阶段，将长纤维解释为短纤维；第二阶段，短纤维降解成PLLA片段，HA纳米颗粒降解成小颗粒并释放Ca²⁺和PO₄^{3 -}；第三阶段，所有pla被分解成乳酸、水和二氧化碳。

图2：压电诱导可控矿化PLLA支架（pcm-PLLA）的制备与表征。(a) pcm-PLLA的合成过程示意图。(b) PLLA和pcm-PLLA的物理表示。(c) pcm-PLLA在PBS中的加速降解实验。(d) pcm-PLLA合成原理示意图。(e) PLLA、PDA/pcm-PLLA及HA/PDA/PLLA不同改性次数的表面SEM图像。(f)超声清洗30 min后pcm-PLLA2表面SEM图像。(g) pcm-PLLA中C、Ca、P元素映射分布。(h)支架的XRD表征。HA的标准卡号是JCPDS:09-0432。(i)不同支架的AFM杨氏模量结果。(j)超声作用下不同HA厚度pcm-PLLA支架的电压输出。(k)不同HA厚度的pcm-PLLA支架在d14方向的压电系数。

图3：pcm-PLLA支架对间充质干细胞的生物学效应。(a) pcm-PLLA支架对MSCs粘附、迁移、增殖和分化的影响。(b) phalloidin和DAPI在不同底物上染色的MSCs生长（12和48 h）(红色：phalloidin， F-actin；蓝色：DAPI，细胞核)。(c)不同基质上MSC生长的方向性统计（48 h）。（d、e） phalloidin（红色：f -actin）和DAPI（蓝色：细胞核）染色（12 h）的MSC三维和平面图像。(f) pcmPLLA支架上MSC生长的SEM图像。(g) pcm-PLLA上MSCs的vinculin（绿色：vinculin）、phalloidin（红色：F-actin）和DAPI（蓝色：细胞核）染色。(h)间充质干细胞的transwell示意图和结晶紫染色（紫色）图片。(i)图3b每个视场的细胞数统计图（0.45 mm²）， n = 3。(j)在不同基质上生长的MSCs在12和48小时的细胞活力。(k) PLLA和pcm-PLLA支架在盐水中的Ca²⁺释放谱。(l)图3h各视场细胞数（1.44 mm²）统计图，n = 3

图4：pcm-PLLA压电对间充质干细胞的生物学效应。(a)压电促进MSCs中Ca²⁺通道的打开，导致细胞内Ca²⁺浓度迅速增加，从而促进成骨相关基因的表达。(b) MSCs细胞内Ca²⁺荧光染色图。(c) MSCs细胞内Ca²⁺荧光随时间的相对荧光强度。（d, e）骨髓间充质干细胞中BMP2和OCN的IF染色。(f) MSCs中成骨相关基因的qPCR（3天）。

图5：pcm-PLLA支架植入10天后的生物效应。(a) pcm-PLLA支架的体内生物学效应示意图。(b) pcmPLLA支架植入过程。(c)图5d视场（0.25 mm²）内细胞数统计图。(d)植入后10天骨缺损的HE染色(S：支架；G:水凝胶)。(e)植入10天后骨缺损中BMP2、OCN、Runx2的免疫荧光染色。(f)图5e中荧光的半定量计数。(g)图5i中CD86 （M1）和CD206 （M2）阳性细胞的荧光半定量计数。(h)图5j中vegf阳性区域的半定量计数。(i)植入10天后骨缺损部位CD86和CD206的IF染色（比例尺= 50 μm）。(j)骨缺损部位VEGF免疫组化染色（比例尺= 50 μm）。

图6：pcm-PLLA支架的体内长期骨修复效果。(a)手术及治疗过程示意图。(b)超声压电作用下支架的体内生物学效应。(c)大鼠颅骨CT图像（比例尺= 5mm）。(d)不同时间的新骨面积。(e)不同时间大鼠颅骨的新BV/TV。(f) 12周后骨缺损部位的MT染色。黑色箭头指向新旧骨的连接处(S：支架；V：新船；B：老骨头；N：新骨；F：胶原纤维)。

图7：植入后4周肿瘤组织转录组检测。(a)群体间共有和独特基因的打乱图。(b)组间差异基因相关分析图。(c) pcm-PLLA + US组相对于Ctrl组的差异基因环图。(d) pcm-PLLA + US组相对于Ctrl组的差异基因富集热图，(e)相对于PLA + US组的差异基因富集热图，以及相关的基因注释。(f) pcm-PLLA + US组相对于对照组和(g)相对于PLA + US组差异基因KEGG富集的气泡图。(h) pcmPLLA + US组相对于Ctrl组和(i)相对于PLA + US组氧化石墨烯差异基因富集的气泡图。(j) pcm-PLLA + US组相对于Ctrl组和(k)相对于PLA + US组的差异基因富集火山图。