周围神经损伤（PNI）是一种常见的临床问题，通常由创伤、机械压迫、代谢紊乱、炎症或感染引起，可能导致严重的残疾和心理负担。目前，自体神经移植是治疗PNI的金标准，但由于供体来源有限且手术风险较高，其应用受到限制。在胚胎发育过程中，神经组织的生长和分化受到内源性电场和细胞间旁分泌信号的调控。受此启发，研究者们开发了一种模拟胚胎发育环境的生物混合神经支架（ND-SENS），旨在通过模拟胚胎发育中的物理和化学信号，促进内源性干细胞的募集和分化，从而实现高效的神经再生，为周围神经损伤的治疗提供一种新的策略。
本期，EFL以发表在《Cell》最新子刊《Cell Biomaterials》上的“A neurodevelopment-inspired self-evolving scaffold for nerve regeneration”研究为例，解析如何用HAMA水凝胶生物支架（ND-SENS）修复受损神经？
为什么选用HAMA水凝胶生物支架（ND-SENS）？
甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶是基于透明质酸（HA）的衍生物，透明质酸是细胞外基质（ECM）的重要组成部分，广泛存在于人体组织中。HAMA水凝胶继承了透明质酸的生物相容性，能够为细胞提供一个接近生理环境的生长基质，减少免疫反应和组织排斥。HAMA水凝胶还具备可以通过紫外光或可见光进行快速光固化，形成稳定的三维网络结构的特性。这种特性使得HAMA水凝胶在制备过程中能够快速成型，并且可以根据需要精确控制其形状和厚度，从而更好地模拟胚胎发育中的细胞外基质环境。除此之外，HAMA水凝胶的化学结构和物理性质与天然ECM相似，能够为干细胞提供一个有利于生长和分化的微环境，促进神经再生。（EFL提供甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）系列水凝胶，详询文末区域销售） 在ND-SENS中，HAMA水凝胶与压电PLLA纤维膜结合，形成一个复合结构。HAMA水凝胶不仅能够模拟ECM的物理和化学特性，还能与PLLA纤维膜的压电特性协同作用，增强支架的整体功能。这种协同作用能够更好地模拟胚胎发育中的内源性电场和化学信号，促进神经再生。如何制备HAMA水凝胶生物支架（ND-SENS）？
首先，通过电纺丝技术制备具有压电特性和有序微纳结构的PLLA纤维膜，并在155°C下退火以增强其结晶度和压电性能。随后，将间充质干细胞（MSCs）接种到PLLA纤维膜上，并添加甲基丙烯酰化透明质酸（HAMA）水凝胶以模拟细胞外基质的环境。接着，将负载细胞的纤维膜卷曲成圆柱形，模拟胚胎神经管的三维结构，并在其外部包裹多孔PLLA壳以提供机械支撑和营养交换通道。最终得到的ND-SENS不仅具有胚胎样的多层结构，还能通过压电效应产生电场，促进干细胞分化和神经营养因子分泌，从而为神经再生提供了一个理想的微环境。HAMA水凝胶生物支架（ND-SENS）的优势及作用
如图1所示，通过电纺丝技术制备的PLLA纤维膜具有高度有序的微纳结构，其分子链在退火处理后从无序变为有序排列，展现出显著的压电特性。实验表明，随着退火温度的升高，PLLA膜的结晶度和压电系数（d14）均增加，最终在155°C退火时达到8.91 pC/N的压电系数。此外，通过COMSOL模拟和实验验证，卷曲成圆柱形的PLLA膜在超声刺激下能够产生稳定的电场输出（最高达±0.35 V），且其频率与超声频率一致，证实了其能够模拟胚胎发育中的内源性电场，为后续细胞分化和神经再生提供了关键的物理信号支持。图2 ND-SENS模拟的胚胎内源性电场可促进负载干细胞的分化和分泌活性如图2所示，首先展示了ND-SENS的制备流程，包括将间充质干细胞（MSCs）接种到PLLA纤维膜上，添加HAMA水凝胶模拟细胞外基质，卷曲成胚胎样圆柱结构，并组装多孔PLLA外壳以增强稳定性和营养交换。扫描电子显微镜（SEM）图像揭示了ND-SENS的多层结构，从外到内依次为多孔PLLA外壳、PLLA纤维膜和细胞层。通过免疫荧光和基因表达分析，发现ND-SENS在超声刺激下能够显著促进MSCs向施万细胞（SCs）分化，并增强神经营养因子（如b-NGF、BDNF和VEGF）的分泌。此外，钙离子成像和Western blot实验表明，ND-SENS通过激活电压门控钙通道（CaV1.2）和机械敏感通道（Piezo1），进而激活Ras-MAPK和PI3K-Akt信号通路，最终促进干细胞的分化和分泌功能。这些结果证实了ND-SENS能够通过模拟胚胎发育中的电环境和化学信号，为神经再生提供一个高效的微环境。 图3 ND-SENS能够募集干细胞并促进组织切片的生长如图3所示，通过Transwell实验，研究者发现ND-SENS能够显著增强周围干细胞的迁移能力，特别是在超声刺激下，迁移细胞数量显著增加，表明其模拟的胚胎微环境能够有效募集内源性干细胞。此外，利用背根神经节（DRG）组织切片模型，研究发现ND-SENS不仅促进了DRG神经纤维的定向生长，还显著增加了神经轴突的长度和神经元标记物（Tuj1）阳性细胞的比例，进一步证实了其在组织再生中的积极作用。这些结果表明，ND-SENS通过其独特的微环境设计，能够有效促进神经再生和组织修复。 图4 ND-SENS在患有周围神经损伤（PNI）的大鼠中成功实现了原位神经修复如图4所示，手术图像和示意图显示了ND-SENS的植入过程，而免疫荧光染色结果表明，ND-SENS组的再生神经组织在成熟神经元标记物（NF200）和施万细胞标记物（S100）的表达上与自体移植组相当，且神经纤维的再生和髓鞘化水平接近自体移植的效果。此外，通过EdU标记的干细胞追踪实验，发现ND-SENS能够促进负载的外源干细胞分化为施万细胞，并且在再生神经组织中，大部分施万细胞来源于内源性干细胞的募集和分化。这些结果表明，ND-SENS通过模拟胚胎发育的微环境，在体内成功实现了高效的神经再生和功能恢复。 图5 ND-SENS在患有周围神经损伤（PNI）的大鼠中恢复了神经传导和运动功能如图5所示，通过透射电子显微镜（TEM）观察到，ND-SENS组的再生神经纤维直径和髓鞘厚度与自体移植组相当，表明其能够实现接近正常的神经再生。此外，通过复合肌肉动作电位（CMAP）测试和步态分析（SFI评分），研究发现ND-SENS组的神经传导功能和后肢运动功能恢复良好，与自体移植组相似。这些结果进一步证实了ND-SENS在神经再生和功能恢复方面的高效性和临床应用潜力。 本文介绍了一种受胚胎发育启发的生物混合神经支架（ND-SENS），旨在解决周围神经损伤（PNI）的修复难题。ND-SENS由压电聚乳酸（PLLA）纤维膜、透明质酸甲基丙烯酸酯（HAMA）水凝胶和间充质干细胞（MSCs）组成，通过模拟胚胎发育过程中的内源性电场和旁分泌信号，促进干细胞分化和神经再生。在体外实验中，ND-SENS显著增强了MSCs的分化和神经营养因子的分泌，并在背根神经节（DRG）模型中促进了神经轴突的定向生长。在体内实验中，ND-SENS在大鼠坐骨神经损伤模型中展现出与自体移植相当的神经修复效果，包括神经纤维再生、髓鞘厚度恢复以及肌肉萎缩改善。转录组分析进一步揭示了ND-SENS通过激活钙离子通道和相关信号通路（如Ras-MAPK和PI3K-Akt）促进神经再生的分子机制。该研究不仅为神经再生医学提供了新的策略，也为未来组织工程研究开辟了新的方向。https://doi.org/10.1016/j.celbio.2024.100006
