《‌‌Science Advances》：一种抗肿胀可生物降解水凝胶通过重塑电微环境促进脑缺损后的内源性神经再生

生物活性基质填充是治疗急性创伤性脑损伤（TBI）相关严重脑缺损的一种前景广阔策略，该方法需要一种兼具抗肿胀和重塑微环境以促进内源性再生双重功能的基质。本研究通过两种美国食品药品监督管理局批准药物（硫辛酸和二甲双胍）的超分子自组装作用，并结合溶液pH值的精确调控，设计出一种抗肿胀、可生物降解的粘附水凝胶。该水凝胶基质重现了天然脑组织的关键特性，包括机械相容性和电相容性。在降解过程中，释放的硫辛酸可将损伤部位重塑为促再生微环境，而二甲双胍则能促进内源性神经干细胞（NSCs）自发募集至缺损区域。结合柔性皮层电极和外源性电刺激，该系统还能引导NSCs分化为功能性神经元。在大鼠严重脑缺损模型中，该策略使NSCs募集量增加14.8倍，神经元分化率提升11.3倍，导致组织缺损体积减少78%并实现显著的功能恢复。本研究为TBI后的内源性修复建立了新的治疗范式。

图1. 结合ES策略的 LMSA 水凝胶的设计与实现。示意图展示了 LMSA 水凝胶的构建及其与ECoG电极的整合方式，用于脑创伤后电刺激（ES）及信号监测。该系统能协同招募并诱导内源性神经干细胞向神经元分化方向分化，同时抑制神经炎症并促进血管生成，从而实现多功能脑修复。

图2. LMSA 水凝胶的表征。(A)显示不同成分LA与Met水溶液凝胶化能力的数码照片；(B)不同浓度LA与Met的相图；(C)不同成分LA、Met及 LMSA 水凝胶的 FTIR 谱图；(D)LA与Met滴定实验的ITC原始数据拟合曲线及热力学参数；(E)不同成分LA、Met及 LMSA 水凝胶的拉曼光谱；(F)不同成分LA、Met及 LMSA 水凝胶的 XRD 图谱。

图3. LMSA 水凝胶的力学与粘附性能。(A)不同成分 LMSA 水凝胶的时间变化曲线。(B)不同成分 LMSA 水凝胶的角频率变化曲线。(C)不同成分 LMSA 水凝胶的剪切速率-黏度关系曲线。(D) LMSA -0.25对各类湿润组织的粘附能力。(E)采用倾斜平面法评估 LMSA 水凝胶的粘附效果。（F和G）不同成分 LMSA 水凝胶的探针粘附测试曲线及**粘附力。（H和I）不同成分 LMSA 水凝胶在新鲜猪皮上的拉伸剪切测试曲线及粘附强度。（J和K）不同成分 LMSA 水凝胶在新鲜猪皮上的180°剥离测试曲线及界面韧性。（L和M）不同成分 LMSA 水凝胶在新鲜猪坐骨神经上的拉伸测试曲线及拉伸力。（n=4；**P<0.01，***P<0.001）

图4. LMSA 水凝胶的电导率特性。(A) LMSA 水凝胶离子传导机制示意图。(B) 不同成分（n=4）LMSA 水凝胶的电导率。(C) 该图比较了 LMSA 水凝胶与既往报道用于创伤性脑损伤治疗的水凝胶在模量、电导率及粘附强度方面的差异。(D) Au电极与水凝胶电极在不同频率范围内的阻抗谱。(E) 1 kHz频率下的阻抗幅值对比（n=5）。(F) 从−0.5 V至0.1 V的循环伏安扫描曲线。(G) 充放电循环次数（CSC）量化结果（n=5）。(H) 经1000次CV循环后的循环后阻抗谱。(I) 在±0.1 V脉冲刺激下的电荷密度瞬态变化。(J) 循环测试期间电荷注入容量的保持情况。（*P<0.05；***P<0.001）

图5. LMSA 水凝胶与胚胎干细胞（ES）的细胞相容性及促进神经干细胞（NSCs）分化活性。(A)活死细胞染色结果表明 LMSA -0.25水凝胶对PC12细胞具有良好的细胞相容性。(B)采用 CCK -8法检测PC12细胞与 LMSA -0.25水凝胶共培养体系的细胞活力（n=6）。(C)采用 CCK -8法检测NSCs与 LMSA -0.25水凝胶共培养体系的细胞活力（n=3）。(D)示意图显示ES与水凝胶联合干预显著促进神经元分化。(E)NSCs划痕实验8小时后的结果。(F)划痕实验中伤口闭合率的定量分析（n=3）。(G)NSCs的巢蛋白（Nestin）和Tuj-1免疫荧光图像：巢蛋白呈红色标记，Tuj-1呈绿色标记；细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色呈蓝色。(H)基于免疫荧光染色结果的Tuj-1阳性表达比值（n=3）。（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

图6. LMSA 水凝胶+胚胎干细胞（ES）可促进损伤区域内源性神经干细胞（NSCs）的募集与分化。(A)照片展示了建立大鼠创伤性脑损伤（TBI）模型的手术流程示意图，以及水凝胶注射和电极植入过程。(B)植入电极的数码照片。(C)实验过程中记录电信号时的大鼠图像。(D)典型胚胎干细胞刺激（ES）疗程持续20分钟。(E)示波器记录的ES波形。(F)Nestin蛋白（绿色）免疫荧光染色图，用于观察损伤后第7天（dpi）内源性NSCs在损伤区域的募集情况；(G)Tuj-1蛋白（绿色）免疫荧光染色图，用于评估损伤后第14天（dpi）NSCs向神经元的分化情况；(H)每个视野中Nestin阳性区域面积的定量结果（n=5）；(I)每个视野中Tuj-1阳性区域面积的定量结果（n=5）；(J)TBI组与TBI+水凝胶+ES组差异表达基因的京都基因与基因组百科全书通路富集气泡图；(K)损伤后第7天p-ERK1/2蛋白（红色）在损伤区域的典型免疫荧光染色图；(L)TBI组与TBI+水凝胶+ES组的基因集富集分析结果；(M)每个视野中p-ERK1/2阳性区域面积的定量结果（n=5），黄色方框标示放大观察区域（*P<0.05，***P<0.001，均与TBI组相比）。

图7. LMSA 水凝胶+胚胎干细胞（ES）可重塑微环境并促进脑组织结构重构。(A)Iba-1（红色）与 GFAP（绿色）的代表性双免疫荧光染色图像，用于研究感染后第7天（7 dpi）病灶部位神经炎症的抑制情况；(B) NF（红色）与 MBP（绿色）的代表性双免疫荧光染色图像，用于评估感染后第28天（28 dpi）病灶部位轴突再生及髓鞘再生情况；（C和D）每视野中Iba-1与 GFAP 阳性区域面积的定量分析（n=5）；(E)感染后第28天大鼠脑组织的数字图像，红色虚线标示组织缺损边界；(F)各组感染后第28天尼氏染色代表性图像，红色虚线同样标示组织缺损边界；(G)每视野胶原蛋白面积的定量分析（n=5）；（H和I）每视野 NF 与 MBP 阳性区域面积的定量分析（n=5）；(J)感染后第28天组织缺损率的定量结果（n=5）；(K)雷达图对比 LMSA 水凝胶+ES与近期报道的创伤性脑损伤（TBI）治疗方法的疗效及修复效果，黄色方框标注放大观察区域（***与TBI组相比P<0.001）。

图8. 脑外伤后ECoG分析及神经功能恢复情况。(A)脑外伤后指定时间点的代表性3分钟ECoG波形图，ED和SD分别以蓝色和红色标出。(B)通过小波变换分析获得的ECoG信号时频特性图。(C) δ + θ / α + β 功率比随时间变化趋势（n=3）。（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。(D)采用mNSS评分评估大鼠神经运动功能恢复情况（n=5）。（E、H）旋转棒测试用于评估大鼠运动协调性和平衡能力（n=5）。（F、I）蔗糖偏好测试用于评估大鼠情绪行为（n=5）。（G至M）莫里斯水迷宫实验中大鼠在学习与空间记忆阶段(K)、逃避潜伏期(J)、目标区域停留时间比例(I)及路径穿越次数(M)的典型游泳轨迹数据（n=5）。（与脑外伤组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。